Laporan Praktikum Genetika : Isolasi DNA, Amplifikasi DNA Menggunakan RAPD, serta Uji Kualitas DNA Menggunakan Elektroforesis Pada Tanaman Melon (Curcumis melo L)

       I.         PENDAHULUAN

a.     Latar Belakang

DNA merupakan molekul yang penting bagi makhluk hidup. DNA merupakan materi genetik yang mampu mengkodekan perintah-perintah untuk mengatur perkembangan maupun respon-respon biologis tertentu. Isolasi DNA merupakan langkah yang sangat penting dalam mempelajari DNA. Terdapat beragam metode yang dapat digunakan dalam isolasi DNA. Metode tersebut seringkali harus disesuaikan dengan tipe sel yang akan kita isolasi DNAnya. Salah satu metode yang dapat digunakan dalam isolasi DNA tumbuhan adalah metode CTAB. CTAB merupakan sejenis detergen yang mampu melisiskan sel. Selain CTAB, diperlukan reagen-reagen lain dalam isolasi DNA mengingat tumbuhan memiliki struktur serta muatan sel yang sangat kompleks dan berpotensi mengkontaminasi hasil isolasi DNA.

Isolasi DNA merupakan langkah awal yang biasa dilakukan dalam studi molekuler keragaman genetik. DNA dari makhluk hidup akan berbeda satu sama lain. Hal ini mengakibatkan keragaman yang tinggi pada makhluk hidup. Salah satu metode yang dapat digunakan adalah RAPD. RAPD atau Random Amplified Polymorphic DNA  merupakan metode amplifikasi menggunakan primer oligonukleotida yang bersifat tidak spesifik. Metode ini dapat digunakan sebagai metode karakterisasi makhluk hidup.

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis memanfaatkan adanya muatan dalam suatu molekul untuk memisahkannya dalam lingkungan medan listrik.

 

b.     Permasalahan

1.   Bagaimana cara mengisolasi DNA dari jaringan tumbuhan dengan metode CTAB?

2.   Bagaimana cara melakukan amplifikasi DNA menggunakan RAPD?

3.   Bagaimana cara melakukan uji kualitas DNA menggunakan elektroforesis?

c.     Tujuan

1.   Melakukan Isolasi DNA dari jaringan tumbuhan dengan metode CTAB.

2.   Melakukan amplifikasi DNA menggunakan RAPD.

3.   Melakukan uji kualitas DNA menggunakan elektroforesis.

 

    II.         TINJAUAN PUSTAKA

a.     Landasan Teori

Ekstraksi biomolekul, termasuk DNA merupakan salah satu metode krusial dalam biologi molekuler. Pada umumnya, isolasi asam nukleat memerlukan empat tahapan yaitu penghancuran sel yang efektif, denaturasi kompleks protein, inaktifasi enzim nuklease, serta purifikasi sehingga tidak terdapat kontaminan (Chee Tan, 2009). Asam nukleat target harus bebas dari kontaminan seperti protein, karbohidrat, lipid, maupun asam nukleat lain. Purifikasi dari protein merupakan langkah penting dalam isolasi DNA. Dalam ekstraksi DNA tanaman, tahapan yang diperlukan diawal adalah menghaluskan jaringan sampel. Pada tahapan ini biasanya digunakan liquid nitrogen untuk mempermudah penghancuran. Pada tahapan ini, dinding sel diharapkan dapat hancur. Namun demikian, perlu ada upaya inaktifasi enzim dan material kimia seluler agar target DNA tidak terdegradasi.

1.     Tahapan isolasi DNA dengan CTAB

Sel tanaman dapat dilisiskan menggunakan CTAB. Cetyltrimethylammonium bromid (CTAB) merupakan detergen yang mampu mempresipitasikan asam nukleat serta polisakarid yang bersifat asam dari larutan dengan kekuatan ionik rendah. Pada kondisi kekuatan ionik yang tinggi, CTAB tidak mampu mempresipitasi asam nukleat dan membentuk kompleks dengan protein (Chee Tan, 2009). Oleh sebab itu, CTAB dapat berguna untuk purifikasi asam nukleat untuk sel dengan kuantitas polisakarida tinggi seperti tumbuhan dan bakteri tertentu. Methode CTAB juga menggunakan pelarut organik dan alkohol dalam tahap presipitasi. Partikel yang tidak larut akan dihilangkan menggunakan sentrifugasi.

Terdapat beberapa tahapan penting dalam isolasi DNA menggunakan CTAB sebagai berikut (M. Somma, 2001).

1.     Melisiskan sel

Tahapan pertama dalam isolasi DNA adalah melisiskan sel. pada tahapan ini, sampel yang homogen diberi dengan buffer EDTA dan CTAB. Membran sel memiliki komponen lipid dan protein yang saling terhubung dengan ikatan nonkovalen. Molekul lipid memiliki kepala hidrofobik dan ekor hidrofilik. CTAB akan menangkap lipid dan protein serta membiarkan DNA genom. Garam spesifik yang ditambahkan kemudian akan mengikatkan DNA kepada detergen. EDTA merupakan buffer yang mampu mengikat magnesium yang merupakan kofaktor DNAse. Dengan adanya pengikatan ion magnesium oleh EDTA, maka DNA akan terhindar dari degredasi. Tris HCL merupakan buffer pH yang penting untuk menyediakan lingkungan bagi DNA agar tidak terdegredasi.

 

2.     Ekstraksi

Pada tahapan ini polisakarida, komponen fenolik serta protein dan lisat lainnya dilarutkan ke dalam fase larutan dan dipisahkan dari kompleks CTAB dan asam nukleat. Pada konsentrasi garam yang rendah, kontaminan dari kompleks asam nukleat tidak dapat larut dan dapat dipisahkan dengan ekstraksi dengan kloroform. Kloroform mendenaturasi protein dan memfasilitasi pemisahan fase organik dan aqueous. Fase aqueous biasanya terdapat diatas, namun demikian, karena konsentrasi garam tertentu maka akan berada di bawah. Asam nukleat akan berada pada fase organik. Ekstraksi menggunakan kloroform dapat diulang sesuai kebutuhan untuk meningkatkan kemurnian.

3.     Presipitasi.

Pada tahap akhir, asam nukleat dibebaskan dari detergen. Pada tahapan ini makaterlebih dahulu dilakukan presipitasi dengan menggunakan campuran CTAB dan garam. Garam diperlukan untuk mempresipitasi asam nukleat. Dengan adanya kondisi buffer dan garam, maka detergen akan dapat dipisahkan dari molekul DNA. Setelah perlakuan ini, maka dapat dilakukan purifikasi dengan etanol 70% untuk membersihkan asam nukleat dari sisa garam yang ada.

2.     Uji kuantitas DNA dengan spektrofotometri

Konsentrasi DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri. Dengan menggunakan spektrofotometer, protein menyerap gelombang 280 nm, DNA 260 nm, sedangkan RNA 280 nm. Rasio kemurnian yang baik adalah rasio kemurnian diatas 1,8 dan mendekati 2. Absorpsi pada panjang gelombang 230 nm menunjukkan adanya kontaminasi dengan materi seperti karbohidrat, peptida, fenol maupun komponen aromatik lainnya. Spektrofotometer mentransmisikan cahaya melalui larutan untuk mengetahui konsentrasi zat terlarut dalam larutan. Nilai absorbansi yang ditunjukkan oleh spektrofotometer akan berbanding lurus dengan konsentrasi yang dimiliki oleh zat terlarut.

3.     Uji kualitas DNA dengan elektroforesis

Elektroforesis agarose merupakan metode yang sering digunkan untuk memisahkan protein, DNA, maupun RNA. Asam nukleat merupakan molekul dengan muatan negatif sehingga dapat bergerak ke kutub positif di bawah medan listrik (Yilmaz et al, 2015). Dalam migrasinya, semakin kecil berat molekul maka akan semakin cepat migrasi yang terjadi. Molekul-molekul dengan ukuran yang sama pada akhirnya akan membentuk band yang sama. Dalam visualisasi molekul asam nukleat, biasanya diperlukan pewarna berupa etidium bromida maupun SYBR green yang mampu berpendar dengan adanya paparan terhadap sinar UV 300 nm.

4.     RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD adalah teknik PCR untuk mengidentifikasi variasi genetik. RAPD menggunakan primer pendek sehingga bersifat tidak spesifik (Kumari & Thakur, 2014). Dengan menggunakan teknik ini, primer akan menyeleksi band yang akan terbentuk dengan sangat spesifik. RAPD menggunakan primer berupa sekuens basa oligonukleotida yang pendek untuk mengamplifikasi genom DNA dengan temperatur annealing yang rendah menggunakan PCR. Hasil amplifikasi kemudian dipisahkan dengan menggunakan gel elektroforesis. Dalam aplifikasi, sama seperti halnya PCR pada umumnya terdapat 3 tahapan yang terjadi. tahapan tersebut adalah sebagai berikut.

1.     Denaturasi

Denaturasi merupakan proses pemisahan untai ganda DNA. pada tahap ini biasanya diperlukan suhu yang cukup tinggi untuk dapat melepaskan ikatan hidrogen antara dua untai DNA.

2.     Penempelan.

Pada tahapan ini biasanya digunakan suhu yang relatif rendah. Dalam tahap ini, primer akan menempel pada sekuens Dna spesifik yang komplemen dengan sekuens yang dimiliki primer.

3.     Pemanjangan

Tahapan ini merupakan tahapan pembentukan sekuens DNA baru. Proses ini dibantu oleh adanya enzim Taq polimerase yang mampu bekerja pada suhu yang tinggi.

b.     Hipotesis

1.   Isolasi DNA dari daun melon dapat dilakukan dengan metode CTAB.

2.   Amplifikasi DNA menggunakan thermo cycler menghasilkan amplikon.

3.   Kualitas DNA dapat dilihat menggunakan elektroforesis.

 

  III.         METODOLOGI PENELITIAN

a.     Alat

Alat yang digunakan dalam isolasi DNA adalah mikropipet beserta tip, microtube 1,5 ml dan 0,5 ml, alumunium foil,vorteks, oven, waterbath, pendingin, serta permanent marker. Alat yang digunakan dalam uji kualitas DNA dengan elektroforesis adalah mikropipet dan tip, erlenmeyer, microwave, glass plate, serta set elektroforator. Alat yang digunakan dalam amplifikasi DNA adalah mesin thermo cycler serta microtube.

b.     Bahan

Bahan yang digunakan dalam isolasi DNA adalah daun melon GMP, HIK, MG3, MG1, TCP, dan MLN masing-masing sebanyak 0,2 gram, CTAB, PVP, merkaptoetanol, CIA, isopropanol, etanol absolut, etanol 70%, buffer TE. Bahan yang digunakan untuk menguji kualitas DNA dengan elektroforesis adalah agarosa, buffer TAE 1X dan 1/2X, flourosafe, loadingdye. Bahan yang digunakan dalam amplifikasi DNA adalah mix PCR Kapa, primer OP7, dH2O, serta sampel DNA.

c.     Cara kerja

1.     Isolasi DNA

Sampel daun terlebih dahulu ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dibalut dengan alumunium foil. Sampel kemudian digerus menggunakan mortar hingga halus dan homogen. Sampel tersebut kemudian ditambahkan 300 µl CTAB 2% serta 0,02 gram PVP lalu dimasukkan ke dalam microtube 1,5 ml. Lalu tambahkan lagi CTAB 2% sebanyak 400 µl. Selanjutnya, ke dalam tube ditambahkan 75 µl merkaptoetanol dan diinversi 7 kali. Sampel dalam tube kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit. Setelah 10 menit, sampel ditambahkan dengan CIA dingin sebanyak 600 µl dan dihomogenasi selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan kemudian dipindah ke tube baru dan ditambahkan dengan isopropanol sesuai dengan volume supernatan yang diambil (1:1). Selanjutnya dilakukan inversi sebanyak 14 kali dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu -20oC. Setelah inkubasi dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan selanjutnya dibuang dan dikering-anginkan sebentar. Selanjutnya ditambahkan 100 µl etanol absolut dan kembali dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rp, selama 10 menit. Selanjutnya supernatan yang dihasilkan dibuang lalu ke dalam tube ditambahkan alkohol 70%. Setelah ditambahkan alkohol 70% selanjutnya kembali dilakukan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan untuk menghilangkan sisa alkohol 70%. Selanjutnya dilakukan penambahan buffer TE sebanyak 50 µl dan disimpan pada suhu -20oC.

2.     Amplifikasi DNA dengan teknik RAPD menggunakan thermo cycler.

Sampel yang akan diloading dipersiapkan terlebih dahulu. Satu tube sampel terdiri dari 12,5 µl mix Kapa, 1 µl MgCl2 , 1,25 µl primer forward, 1,25 µl primer reverse, 5 µl DNA template, serta 4 µl ddH2O. Tube berisi campuran tersebut kemudian ditata di dalam thermo cycler dan diatur untuk suhu predenaturasi 95oC selama 5 menit, suhu annealing 40oC selama 15 detik, suhu extension 72oC selama 20 detik, serta suhu final extension sebesar 72oC selama 5 menit dengan jumlah ulangan siklus sebanyak 35 kali. Setelah proses amplifikasi selesai kemudian sampel dapat disimpan pada suhu sekitar 4oC hingga 12oC serta selanjutnya dilakukan uji kualitas dengan menggunakan elektroforesis.

3.     Uji kualitas DNA menggunakan elektroforesis

Pada uji kualitas DNA genom menggunakan elektroforesis, terlebih dahulu disiapkan agarose dengan konsentrasi 1%. Sebanyak 0,4 gram agarose dimasukkan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan dengan 40 ml TAE 1X lalu digojok hingga homogen. Sedangkan untuk uji kualias produk PCR digunakan 2% agarose dengan melarutkan 0,8 gram agarose ke dalam 40 ml TAE. Larutan agarosa kemudian dipanaskan dalam microwave selama 50 detik. Setelah agak dingin, ditambahkan dengan flourosafe sebanyak 2 µl dan digojok hingga homogen. Gel kemudian dituangkan dalam cetakan dan didiamkan hingga memadat lalu setelah memadat sisit dilepas kembali. Gel dipindahkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TAE 1/2x.

Sembari menyiapkan set elektroforesis, sampel yang akan diloading ke dalam sumuran dipersiapkan terlebih dahulu. Untuk sampel genom, diambil sebanyak 5 µl sampel serta ditambahkan dengan loading dye sebanyak 1 5 µl. Setelah sampel siap di dalam sumuran, elektroforator dihubungkan dengan sumber listrik dan di atur pada tegangan 100V selama 30 menit. Setelah selesai, hasilnya diamati menggunakan sinar UV.

 

  IV.         HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada praktikum ini telah dilakukan praktikum isolasi DNA, uji kualitas DNA dengan elektroforesis, serta amplifikasi DNA dengan thermocycler.

Kegiatan pertama yang dilakukan adalah isolasi DNA. Dalam praktikum ini dilakukan isolasi DNA menggunakan CTAB. Langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang sampel sebanyak 0,2 gram. Sampel yang digunakan adalah sampel daun melon melon GMP, HIK, MG3, MG1, TCP, dan MLN. Sampel tersebut dipilih yang tidak terlalu tua sehingga tidak memiliki kandungan metabolit sekunder yang terlalu banyak yang dapat mengganggu kemurnian DNA nantinya.

Tulang daun pada tanaman merupakan bagian yang sedapat mungkin dihilangkan karena akan mengganggu proses penghancuran sel. selain itu, tulang daun merupaka representasi berkas pengangkut sehingga tipe sel yang ada di dalamnya cukup banyak sel mati atau tidak memiliki protoplas. Oleh sebab itu, keberadaan tulang daun sebaiknya dihindari. Tulang daun juga merupakan sarana transportasi sehingga di dalam tulang daun kemungkinan terdapat berbagai macam substansi yang bukan merupakan target isolasi, yaitu DNA. Sampel yang sudah ditimbang disimpan pada alumunium foil dan disimpan pada suhu rendah agar metabolisme pada sel-sel sampel tidak berlanjut. Suhu yang rendah mampu menurunkan aktifitas enzim sehingga reaksi-reaksi dalam sel menjadi lebih lambat. Keadaan ini penting sehingga keadaan sel dalam jaringan tetap baik selama penyimpanan sampel.

Setelah sampel selesai disiapkan, langkah selanjutnya adalah menghaluskan sampel dengan mortar. Langkah ini bertujuan untuk menghancurkan dinding sel. Pada langkah ini ditambahkan sebanyak 300 µl CTAB dengan suhu 60oC serta o,o2 gram PVP. Penambahan CTAB bertujuan untuk melisiskan membran sel. selain itu, perbedaan suhu penyimpanan serta suhu CTAB yang ditambahkan diharapkan dapat memberikan shock temperatur bagi membran sel sehingga mudah dilisiskan. CTAB merupakan sejenis detergen yang mampu melisiskan dinding sel. Sedangkan penambahan PVP bertujuan untuk menghilangkan polifenol yang merupakan agen pengoksidasi yang mampu menurunkan kemurnian DNA hasil ekstraksi ekstraksi (Khanuja et al, 1999). Selanjutnya, sampel yang sudah homogen serta telah ditambahkan CTAB dan PVP dipindahkan ke dalam microtube 1,5 ml serta ditambahkan kembali 400 µl CTAB dan 75 µl merkaptoetanol.

Fungsi dari merkaptoetanol adalah untuk mendenaturasi protein (Miguel Dita & Martinez de la Parte, 2014). Setelah penambahan CTAB dan merkaptoetanol dilakukan inversi agar larutan menjadi homogen. Homogenasi ini penting agar kontak buffer dengan substansi yang akan dilisiskan lebih maksimal. Selanjutnya, sampel diinkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit untuk denaturasi protein lebih lanjut. Suhu yang lebih tinggi akan mampu mempercepat proses denaturasi protein.

Setelah inkubasi selesai, sampel kemudian ditambahkan dengan CIA 600 µl dingin dan dilakukan homogenasi selama 20 menit. Penggunaan CIA berperan dalam purifikasi DNA. Kloroform dalam CIA berperan dalam mendenaturasi protein dan menghilangkan lipid. Isoamil alkohol berperan dalam pemisahan fase, penrunan jumlah material dalam fase aqueous dan interfase organik, serta mengurangi terbentuknya buih. CIA diberikan dalam keadaan dingin sehingga kerapatan molekul protein dan debris lainnya tinggi sehingga akan berada di bagian bawah tabung saat dilakukan sentrifugasi pada langkah berikutnya. Pada tahapan ini materi dengan massa jenis dan kelarutan yang sama akan berada dalam fase yang sama sehingga membentuk gradien fase. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.

Setelah sentrifugasi, supernatan dipindahkan ke dalam tube baru menggunakan mikropippet. Kemampuan pipeting yang baik akan membantu keberhasilan isolasi DNA. Pengambilan supernatan harus dilakukan dengan sangat hati-hati agar debris tidak kembali bercampur ke dalam supernatan dan kemudian mengurangi kemurnian isolat DNA.

Selanjutnya dilakukan penambahan isopropanol sebanyak supernatan yang diambil sebelumnya. Fungsi dari isopropanol adalah untuk mempresipitasi DNA. Isopropanol akan mengakibatkan kerapatan dsDNa meningkat sehingga mudah terpresipitasi. Isopropanol memiliki konstanta dielektrik yang lebih kecil dari air. Isopropanol bersifat lebih tidak polar daripada etanol absolut. Hal ini mengakibatkan kemungkinan adanya garam tertentu yang tidak dapat larut saat dilakukan presipitasi dengan isopropanol.

Setelah ditambahkan isopropanol dilakukan inversi sebanyak 14 kali dan inkubasi selama 10 menit pada suhu -20oC. Inkubasi pada suhu rendah juga akan meningkatkan kerapatan molekul DNA. Dengan demikian, pada tahap selanjutnya yaitu sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm diperoleh pelet DNA di dasar tube. Sampel kemudian dikeringanginkan sebentar.

Setelah presipitasi menggunakan isopropanol, dilakukan kembali presipitasi menggunakan etanol absolut. Etanol absolut bersifat lebih polar sehingga lebih mampu melarutkan garam-garam yang mungkin terdapat dalam sampel DNA. Setelah penambahan etanol absolut kemudian dilakukan sentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit. Superatan yang dihasilkan kemudian dibuang. Selanjutnya ditambahkan etanol 70% sebagai tahap pencucian. Setelah itu, kembali dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. setelah selesai, supernatan dibuang dan sampel dikeringkan. Pengeringan tidak boleh dilakukan berlebihan karena dapat menurunkan kelarutan DNA pada buffer penyimpan selanjutnya. Setelah DNA kering, kemudian ditambahkan TE sebanyak 50 µl sehingga DNA bebas dari kemungkinan adanya degradasi serta lebih mampu bertahan dalam masa penyimpanan.

Setelah berhasil diisolasi, genom kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer. Hasilnya adalah sebagai berikut.

Tabel 1. Hasil Spektrofotometri

Sampel

Konsentrasi

(ng/ µl)

A 230

A260

A280

A260/280

A260/230

GMP

2628

28,26

54,64

27,58

2,061

2,008

HIK

1004

10,64

21,12

10,71

2,075

2,091

MG3

1200

14,19

25,51

13,57

1,990

1,893

MG1

3248

34,32

67,04

34,26

2,019

2,015

TCP

1906

19,00

39,08

19,00

2,113

2,113

MLN

4033

41,10

81,94

41,68

1,997

2,026

 

Nilai 260/280 idealnya berada pada kisaran 1,8 hingga 2. Pada praktikum ini, diketahui nilai tersebut pada masing-masing sampel yang dianalisis memiliki nilai melebihi dua. Hal ini mengindikasikan adanya kontaminasi substansi lain. selain itu, nilai absorbansi 230 juga tergolong tinggi. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan adanya kontaminasi senyawa  seperti karbohidrat, peptida, fenol maupun komponen aromatik lainnya.

Pada kegiatan selanjutnya, dilakukan amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan untuk menghasilkan produk berupa amplikon yang merupakan sekuens DNA tertentu. Pada praktikum ini, sampel yang akan diloading dipersiapkan terlebih dahulu. Satu tube sampel terdiri dari 12,5 µl mix Kapa, 1 µl MgCl2 , 1,25 µl primer forward, 1,25 µl primer reverse, 5 µl DNA template, serta 4 µl ddH2O. Primer yang digunakan dalam praktikum ini adalah primer RAPD OPA-07 yang memiliki sekuens 5’-GAACGGGTG-3’. 

Tube berisi campuran tersebut kemudian ditata di dalam thermo cycler dan diatur untuk suhu predenaturasi 95oC selama 5 menit, suhu annealing 40oC selama 15 detik, suhu extension 72oC selama 20 detik, serta suhu final extension sebesar 72oC selama 5 menit dengan jumlah ulangan siklus sebanyak 35 kali. Dalam RAPD ini, sekuens primer oligonukleotida akan berperan sebagai primer forward sekaligus reverse. Primer ini akan menempel pada banyak lokasi pada genom. Daerah antara primer forward dan reverse yang berlawan arah dan berdekatan kemudian akan mampu mensintesis sekuens DNA. Setelah proses amplifikasi selesai kemudian sampel diuji kualitasya dengan menggunakan elektroforesis. Hasil analisis elektroforesis yang diperoleh adalah sebagai berikut.



Gambar 1. Hasil Elektroforesis DNA Genom

 



Gambar 2. Hasil Elektroforesis DNA Produk RAPD

 

Hasil elektroforesis DNA genom (Gambar 1) pada keenam sampel daun melon menunjukkan adanya smear yang cukup terang. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi pada hasil isolasi DNA yang didapatkan. Pada saat isolasi DNA di awal, diketahui bahwa pelet yang dihasilkan cenderung berwarna putih dan kecoklatan. Hal ini menunjukkan kemungkinan adanya polisakarida serta senyawa fenol. Nilai absorbansi 320 nm serta 230 nm juga cukup tinggi. Apabila demikian, maka sebaiknya dilakukan pengulangan tahapan pemberian CTAB dan PVP serta merkaptoetanol. Hasil isolasi DNA yang baik seharusnya menunjukkan warna bening saat diamati secara langsung sebab DNA hanya mampu menyerap sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm sehingga tidak tampak dengan mata secara langsung yang hanya mampu menangkap sinar tampak (400-750 nm). Hasil ini menunjukkan bahwa tingginya kuantitas yang ditunjukkan oleh spektrofotometer belum menjamin tingginya kualitas setelah diuji dengan elektroforesis.

Pada Gambar 2, diketahui bahwa PCR produk tidak dapat dilihat dengan jelas. Dengan menggunakan primer OPA-07 seharusnya didapatkan 7 fragmen dengan perbandingan 3 fragmen DNA polimorfik dan 4 fragmen DNA monomorfik dengan ukuran DNA sekitar 200-1000 bp (Latifah, 2016). Namun demikian, band tersebut tidak dapat teramati. Hal ini dimungkinkan oleh adanya beberapa faktor seperti pembuatan gel yang belum rata kelarutannya, ketidakberhasilan PCR karena terdapat gelembung pada mix sampel, maupun kesalahan yang mungkin terjadi karena alat yang elektroforator yang tidak stabil.

 

    V.         KESIMPULAN

1.   Isolasi DNA dari jaringan daun tanaman melon dapat dilakukan dengan menggunakan metode CTAB.

2.   Amplifikasi DNA dapat dilakukan dengan primer oligonukleotida yang bersifat tidak spesifik menggunakan teknik RAPD.

3.   Elektroforesis dapat digunakan untuk menguji kualitas DNA hasil isolasi maupun amplifikasi.

 

  VI.         DAFTAR PUSTAKA

Chee Tan, Siun, Beow Chin Yiap. 2009. DNA, RNA, and Proein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology Vol 2009  Article ID 574398

Khanuja, Suman P.S., Ajit K Shasany, MP Darokar, Sushil Kumar. 1999. Rapid Isolation of DNA from Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secondary Metabolites and Essential Oils. Plant Molecular Biology Reporter 17: 1–7, 1999

Latifah, Yulia Wahyu. 2016. Kestabilan Karakter Fenotip dan Molekuler Melon (Curcumis melo L) Hasil Segregasi dan Seleksi Populasi. Skripsi. Universitas Gadjah Mada

M. Somma. The Analysis of Food Samples for the Presence of Genetically Modified Organism Sesion 4: Extraction and Purification of DNA. Online http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN/Session04.pdf diakses Sabtu, 20 Mei 2017

Miguel Dita & Einar Martinez de la Parte. 2014. Basics Aspect of Molecular Biologi and DNA Extraction. Online http://www.fao.org  diakses Sabtu, 20 Mei 2017

Nandani Kumari and Saroj Kumar Thakur. 2014. Randomly Amplified Polymorphic DNA-A Brief Review. American Journal of Animal and Veterinary Sciences 9 (1): 6-13

Porebski, S., Bailey, L.G. & Baum, B.R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components.  Plant Mol Biol Rep (1997) 15: 8. doi:10.1007/BF02772108

Yilmaz, Muhittin, Cem, Ozic, Ilhami Gok. 2015. Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis. Intech

 

VII.         LAMPIRAN

 

 

Heterosis dan Potensi Peningkatan Produktifitas Agrikultur!

Pernah dengar istilah benih hibrida? Inilah heterosis, fenomena dibalik terciptanya benih hibrida! Heterosis merupakan fenomena di mana gene...

Yang Paling Sering Dibaca

Blog Archive