Journal Reading: Mitochondria Localize to the Cleavage Furrow in Mammalian Cytokinesis

Elizabeth J. Lawrence, Craig A. Mandato*

Department of Anatomy and Cell Biology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada

Abstrak

Mitochondria are dynamic organelles with multiple cellular functions, including ATP production,  alcium buffering, and lipid biosynthesis. Several studies have shown that mitochondrial positioning is regulated by the cytoskeleton during cell division in several eukaryotic systems. However, the distribution of mitochondria during mammalian cytokinesis and whether the distribution is regulated by the cytoskeleton has not been examined. Using live spinning disk confocal microscopy and quantitative analysis of mitochondrial fluorescence intensity, we demonstrate that mitochondria are recruited to the cleavage furrow during cytokinesis in HeLa cells. After anaphase onset, the mitochondria are recruited towards the site of cleavage furrow formation, where they remain enriched as the furrow ingresses and until cytokinesis completion. Furthermore, we show that recruitment of mitochondria to the furrow occurs in multiple mammalian cells lines as well as in monopolar, bipolar, and multipolar divisions, suggesting that the mechanism of recruitment is conserved and robust. Using inhibitors of cytoskeleton dynamics, we show that the microtubule cytoskeleton, but not actin, is required to transport mitochondria to the cleavage furrow. Thus, mitochondria are specifically recruited to the cleavage furrow in a microtubule-dependent manner during mammalian cytokinesis. Two possible reasons for this could be to localize mitochondrial function to the furrow to facilitate cytokinesis and / or ensure accurate mitochondrial inheritance.

Pendahuluan

Sitokinesis adalah tahapan akhir dari pembelahan sel dan menghasilkan dua anakan sel yang sama. Beragam bagian dari sel turut serta dalam proses pembelahan dari mulai pembentukan lekukan awal hingga akhirnya sitokinesis berakhir. Mitokondria adalah organel yang memproduksi ATP. Mitokondria merupakan organel yang dinamis pada sel-sel eukariot sehingga memungkinkan untuk berubah kedudukan pada saat-saat tertentu. Beberapa studi menunjukkan bahwa mitokondria dikendalikan oleh sitoskeleton. Meskipun demikian, belum diketahui bagaimana lokasi spesifik mitokondria selama pembelahan sel serta jenis sitoskeleton apa saja yang berperan. Studi ini bertujuan untuk mengamati distribusi mitokondria selama sitokinesis pada kultur sel mamalia menggunakan mikroskop konfokal serta mengamati peran aktin dan mikrotubulus dalam menentukan posisi mitokondria selama pembelahan sel.

Material dan Metode

Kultur sel dan Drug Treatments

Sel mamalia dipelihara pada suhu 37 derajat dengan oksigen 5% pada inkubator dengan media yang mengandung 10% FBS dan 2 nM. Sel HeLa, Ptk2, dan Vero ditumbuhkan di MEM ssedangkan C2C12 ditumbuhkan dii DMEM. Untuk mewarnai mitokondria, sel hidup diinkubasi 30 menit dengan nM MitoTracker Red CMX Ros atau MitoTracker Green dalam keadaan gelap. Drug treatment untuk aktin sel diberikan media dengan 0,1% DMSO (sebagai kontrol), 100 nM Lantrunculin A atau 500 nM Jasplakinolide. Drug treatment untuk mikrotubulus digunakan media 0,1% DMSO (sebagai kontrol), 20µM Nocodazole atau 10µM Taxol. Sel dengan spindel monopolar dipelihara pada inkubasi dengan 100µM Monastrol selama 2 hingga 12 jam dan anafase diinduksi dengan penambahan 30µM Purvalanol.

Immunofluoresen

Sel difiksasi dengan 3,2% paraformaldehid di PBS selama 15 menit. Sebelum perlakuan antibodi, sel dipermeabilisasi dengan PBS yang berisi 0,1% Triton X-100 dan diblok dengan 2% BSA dalam PBS selama 30 menit. Sel diinkubasi pada suhu 4oC semalaman dan selama 45 menit pada suhu ruangan dengan antibodi. F-aktin diwarnai dengan Phalloidin 488 dan DNA diwarnai dengan DAPI.

Pengamatan Mikroskop dan Penggambaran

Gambar diperoleh dengan menggunakan Confocal LSM 510 META Confocal System pada Zeiss Axiovert 200M inverted microscope. Untuk pengamatan hidup, sel HeLa ditumbuhkan pada glass-bottom dishes 35 mm dan dipelihara pada media MEM bebas fenol pada suhu 37oC dan CO2 5%.

Analisis Gambar dan Statistik

Intensitas flouresen pada lima tahapan pembelahan sel dikuantifikasikan. Tahapan pembelahan tersebut adalah metafase, anafase, sitokinesis awal, sitokinesis tengah, dan sitokinesis akhir. Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan F-Test (ᾳ=5%).

Hasil

Sel HeLa dengan pewarnaan MitoTracker Red yang digunakan untuk mengamati mitokondria menunjukkan bahwa mitokondria melokalisasi celah pembelahan dan mengosongkan kutub sel pada pembelahan sel mamalia. Hasil analisis flouresensi mitokondria menunjukkan bahwa polarisasi mitokondria dari kutub ke area celah pembelahan mengalami peningkatan pada setiap kenaikan fase pada lima fase pembelahan.  

Distribusi mamalia pada sitokinesis berbeda dari ER, Golgi, dan Lisosom. Sel HeLa dengan pewarnaan MitoTrackerRed, ER dengan anti-GRP-170, golgi dengan anti-Golgin-97, lisosom dengan (anti-Lamp-1), dan DNA dengan DAPI. Sama seperti hasil sebelumnya, mitokondria menempati pagian celah pembelahan dan berkurang pada bagian kutub sel. ER terdistribusi di seluruh sitoplasma kecuali area yang ditempati oleh kromosom. Golgi terdispersi di sitoplasma namun paling banyak di daerah kutub spindel. Lisosom terlokalisasi di area tengah mikrotubulus dan kutub spindel.

Mitokondria melokalisasi celah pembelahan pada pembelahan multipolar dan monopolar. Pada kultur sel HeLa, pengamatan mitosis sel tripolar dan tetrapolar. Pada pembelahan multipolar tersebut, mitokondria terakumulasi pada setiap celah pembelahan.

Sitoskeleton aktin tidak diperlukan untuk penautan mitokondria ke celah pembelahan. Penggunaan inhibitor aktin berupa Latrunculin atau Jasplakinolide untuk mendepolarisasi atau menstabilkan aktin menjukkan mitokondria berpindah dari kutub ke area ekuator. Sedangkan Jasplakinolide mitokondria menempati ekuator dan mengosongkan area kutub sehingga aktin tidak berpengaruh signifikan pada pergerakan mitokondria.

Mikrotubulus mengatur penempatan Mitokondria ke celah pembelahan. Perlakuan Nocodazole dan Taxol menunjukkan bahwa perlakuan pada mikrotubulus mengurangi akurasi penempatan  mitokondria

Kesimpulan

Mitokondria ditarik ke celah pembelahan dan jauh dari kutub sel selama sitokinesis pada sel mamalia dengan menggunakan mekanisme microtubule-dependent. Posisi mitokondria oleh mikrotubulus membantu akurasi pembagian mitokondria ke sel anakan selama sitokinesis. Selain itu, lokalisasi mitokondria di daerah celah pembelahan mungkin memfasilitasi sitokinesis dengan meningkatkan aktifitas mitokondria. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan mekanisme molekuler dari celah pembelahan pada sitokinesis.